2022年4月 第301302期

HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药机制研究

中山大学孙逸仙纪念医院龚畅教授和李隽教授领衔的研究团队,从曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌患者样本中,筛选出关键的环状RNA CDYL2(cirCDYL2),揭示了cirCDYL2-GRB7-FAK通路促进曲妥珠单抗耐药的原理。研究弥补了临床预测曲妥珠单抗疗效和耐药的生物学指标空白,为逆转曲妥珠单抗耐药提供了治疗思路。(Mol Cancer. 2022, 21: 8. DOI: 10.1186/s12943-021-01476-7)

已有诸多研究发现环状RNA能调节恶性肿瘤细胞的增殖、转移,在包括乳腺癌的恶性肿瘤耐药中扮演关键角色。龚畅教授团队利用高通量测序技术,从对曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌患者的肿瘤样本中,筛选出特异性高表达的环状RNA分子cirCDYL2。

通过分析127个接受过曲妥珠单抗治疗的HER2阳性早期乳腺癌患者的数据发现,高表达cirCDYL2的乳腺癌肿瘤,肿瘤的尺寸更大,淋巴转移能力和增殖能力更强,复发率更高,患者无病生存期及总生存期更短。cirCDYL2高表达的肿瘤中,Ki67(肿瘤增殖相关蛋白)表达,磷酸化AKT(P-AKT)和磷酸化ERK(P-ERK)的量更高,研究者推测cirCDYL2与HER2阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗耐药有关。

研究者用HER2阳性乳腺癌患者的癌细胞构建了人源肿瘤异种移植模型(PDX),通过连续4周瘤内注射小干扰RNA阻止cirCDYL2发挥作用(沉默),发现cirCDYL2被沉默的实验组对曲妥珠单抗更敏感,肿瘤中的Ki67、P-AKT和P-ERK表达量都显著下降。

研究者构建了两个曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3和BT474。发现沉默cirCDYL2后,虽不影响两个肿瘤细胞系的凋亡,但肿瘤细胞的活力、迁移能力、形成克隆的能力均减弱。cirCDYL2的表达量下调也导致磷酸化AKT和ERK1/2的表达量下调。实验还发现cirCDYL2的变化并不影响HER2阴性的乳腺癌细胞增殖。这些实验结果说明cirCDYL2与HER2阳性乳腺癌细胞的曲妥珠单抗耐药有关。

研究者发现HER2与cirCDYL2之间没有直接的调控关系,其中一个分子的表达量变化,不会直接影响另一个分子,推测cirCDYL2应该跟HER2相关的信号通路蛋白有相互作用。

通过蛋白质体外结合实验、环状RNA拉下实验、免疫沉淀等实验结果,研究者终于确定cirCDYL2与GRB7信号蛋白存在相互作用。cirCDYL2是通过GRB7蛋白去促进HER2+乳腺癌细胞的曲妥珠单抗耐药。

进一步分析这两个分子之间的相互作用,研究者发现cirCDYL2使GRB7蛋白变得稳定,但敲除cirCDYL2对GRB7的mRNA表达水平无显著影响。研究者判断cirCDYL2对GRB7的作用是发生在转录翻译之后。

之前研究已发现,GRB7可通过泛素化完成降解,研究者猜想cirCDYL2能影响GRB7的泛素化水平。研究者发现,将细胞内的Pin1蛋白基因(GRB7的稳定性的调控蛋白)敲除,可增加GRB7蛋白的稳定性,转染Pin1会提升GRB7蛋白泛素化水平。免疫沉淀实验发现,过表达cirCDYL2可以在过表达Pin1的细胞环境下,提升GRB7蛋白稳定性,相比仅过表达Pin1的细胞,同时过表达cirCDYL2和Pin1的细胞有更多GRB7蛋白可被沉淀下来。cirCDYL2是通过干预Pin1蛋白来抑制GRB7的泛素化降解,导致GRB7表达量上调。

研究者们利用RNA结合蛋白免疫沉淀等实验发现,FAK蛋白与circCDYL2存在相互作用。且相比对照组,过表达cirCDYL2的细胞中,能发现更多FAK与GRB7蛋白结合的现象,即circCDYL2可促进GRB7与FAK结合。将FAK沉默后,对曲妥珠单抗耐药的细胞中P-AKT和P-ERK变少,意味着耐药性减弱。说明cirCDYL2是通过FAK来促进HER2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药。

研究者为在体内证明HER2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗耐药确实与cirCDYL2-GRB7-FAK的作用机制有关,将SK-BR-3细胞改造成过表达cirCDYL2的P-SK-BR-3细胞和敲除cirCDYL2的SK-BR-3-R细胞,并原位注射到小鼠乳房脂肪垫,实验组小鼠一周注射两次曲妥珠单抗,44天后将肿瘤取出观察结果。

结果发现,仅敲除cirCDYL2或者注射曲妥珠单抗这两种手段对已经耐药的肿瘤生长无明显影响,但在敲除cirCDYL2且注射曲妥珠单抗的实验组,肿瘤生长被显著抑制。这说明敲除cirCDYL2可以逆转肿瘤对曲妥珠单抗的耐药。

使用FAK或者GRB7蛋白抑制剂干预,也可以达到敲除cirCDYL2类似的效果。即使是过表达cirCDYL2的肿瘤,使用FAK或者GRB7蛋白抑制剂也可以缓解曲妥珠单抗耐药。cirCDYL2确实促进曲妥珠单抗耐药,FAK及GRB7蛋白抑制剂可缓解曲妥珠单抗耐药。

该研究揭示了cirCDYL2-GRB7-FAK通路在维持HER2表达中的关键作用,及其参与曲妥珠单抗耐药的机理。同时证实cirCDYL2可以作为曲妥珠单抗耐药、HER2阳性乳腺癌患者的潜在的标志物,弥补了临床预测曲妥珠单抗疗效和耐药的生物学指标空白,进而优化患者临床治疗方案。FAK或GRB7抑制剂、cirCDYL2沉默或可成为逆转曲妥珠单抗耐药的治疗思路。 (编译 于娜)


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