西湖大学谢琦等，基于计算蛋白质设计的方法从头设计并筛选得到了针对胶质母细胞瘤表面的高表达的肿瘤抗原EGFR和CD276两个靶点高亲和力的迷你结合蛋白（Binder）CAR结构，同现阶段临床试验中的相同靶点的scFv CAR结构相比较，在临床前模型中Binder CAR显著提高了CAR T疗法对于胶质母细胞瘤的治疗效果。（Nat Biomed Eng. 2024年10月17日在线版）

CAR-T是新型肿瘤免疫疗法，通过基因工程改造患者T细胞，利用CAR结构的胞外抗原结合结构域识别肿瘤细胞表面抗原并通过胞内信号域激活T细胞，有效地识别并攻击肿瘤细胞。CAR在血液系统恶性肿瘤的治疗领域已取得巨大成功，国内外已有多款针对血液肿瘤的CAR T药物上市。

CAR T疗法对包括胶质母细胞瘤在内的诸多实体瘤效果却十分有限。为进一步提升CAR T细胞在治疗实体瘤时的疗效，当前多数研究致力于改良CAR T细胞内的共刺激信号传导结构域或通过基因编辑系统重编程细胞状态，以达到提升其治疗实体瘤时的疗效的目的。

作为肿瘤细胞特异性识别的核心部件，CAR T细胞的细胞外抗原结合结构域，基本上沿用初代CAR T采用单链抗体的设计。然而，scFv由单克隆抗体的轻链（VL）和重链（VH）通过Linker连接而成，因此单链抗体的重、轻链易发生错误聚集和折叠，结构稳定性较差，不仅影响了T细胞识别抗原细胞能力，还可引起非抗原依赖性的T细胞激活，导致T细胞的过早耗竭，极大降低了CAR-T疗法治疗效果。开发不依赖于传统单链抗体的CAR T抗原结合结构域的新策略，可能为提高CAR T细胞治疗实体瘤疗效开辟蹊径。

研究者开发了一套使用Binder代替传统scFv作为抗原结合结构域的新型CAR构建策略，用于有效识别肿瘤表面抗原，并提高CAR T疗法对于胶质母细胞瘤的治疗效果。该策略从已知癌症靶标的蛋白结构入手，选择合适的靶蛋白表面，并利用游离氨基酸匹配和空间匹配算法获得与该表面契合的Binder空间位置，使用Rosetta平台，通过能量打分函数对Binder的氨基酸序列进行设计，并进行多轮迭代优化，得到了对于肿瘤靶标具有良好的稳定性和良好的识别结合能力的Binder蛋白（约55~60个氨基酸）。再将优化完成的Binder蛋白与二代CAR结构进行组装，并在体内体外多层次验证其生物学功能。

研究者首先从已报道的EGFR binder入手，用于验证Binder CAR T该项设计的可行性。他们尝试将EGFR binder整合入具有4-1BB或是CD28共刺激结构域的二代CAR结构中，同时采用现阶段临床试验进行中的相同靶点的EGFR scFv结构也用相似的策略构建产生scFv CAR作为实验对照。

研究者对Binder CAR T的性质进行了系统性的功能分析，包括在CAR T细胞在体外与胶质母细胞瘤干细胞或胶质母细胞瘤原代肿瘤细胞的体外共培养体系中评估Binder CAR T与传统scFv CAR T肿瘤杀伤，细胞增殖、细胞毒性细胞因子分泌和T细胞耗竭以及转录组水平变化等多个指标。

实验结果显示，EGFR binder CAR T细胞在所有这些方面的表现都明显优于EGFR scFv CAR T细胞，其在面对高负荷的肿瘤压力的情况下，Binder CAR T维持了更高的肿瘤杀伤能力，更高的细胞因子分泌水平以及较强的细胞增殖能力，并且在肿瘤负荷下表现出较低的肿瘤耗竭指标的表达。

而在小鼠原位胶质母细胞瘤异种移植模型以及免疫健全小鼠模型中，EGFR binder CAR T细胞相较于传统EGFR scFv抑制了肿瘤生长，显著延长了小鼠的存活时间，显示卓越的抗肿瘤功效，且无明显的毒副作用。

为进一步验证Binder CAR T设计策略的是否具备有广谱的适用性，研究者沿用相同策略，从头设计了一种专门针对另一种胶质母细胞瘤抗原CD276的binder CAR T。与CD276 scFv CAR T细胞相比，工程改造的CD276 binder CAR T细胞也在体外和体内均表现出卓越的肿瘤杀伤能力，这表明Binder CAR T策略对不同靶点均具有可行性。

该研究开发了基于蛋白质从头设计技术的Binder蛋白替代传统的scFv作为CAR T抗原结合域的新策略，在临床前模型中展示出了优异的抗肿瘤效果。基于此，在西湖大学和西湖实验室的大力支持下，研究者和临床医院合作，正在开展基于CD276 binder CAR T治疗复发性胶质母细胞瘤的研究者发起的临床试验，有望为胶质母细胞瘤的治疗提供新助力。

（编译 张俊熙）