2020年度诺贝尔化学奖颁给在CRISPR基因编辑领域做出卓越贡献的现在德国工作的法国科学家Emmanuelle Charpentier教授和美国加州大学Jennifer Doudna教授，表彰她们发明基因修饰方法CRISPR-Cas9，CRISPR基因编辑这一革命性发现为整个生物技术领域提供了无限可能。

CRISPR技术的故事

30年前，一位名为Francisco Mojica的年轻人在一座名为圣波拉(Santa Pola)的地中海小城一所大学开始攻读博士学位，他的研究对象就是圣波拉海滩上发现的一种古细菌。

在分析这种古细菌的DNA序列时，年轻的Mojica观察到了一个有趣的现象——这些微生物的基因组里，存在许多奇怪的“回文”片段。这些片段长30个碱基，且会不断重复。在两段重复之间，则是长约36个碱基的间隔。对于这种具有规律性的重复，Mojica将其命名“常间回文重复序列簇集”(Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats。，缩写就是CRISPR)。

事实上，这并非人类首次发现CRISPR序列。早在1987年，日本研究者(石野良纯教授为第一作者)就已发表论文，表明大肠杆菌里也有类似的序列。不少学者认为，这是人类首次知道CRISPR序列的存在。日本团队当时并未对CRISPR序列进行详细研究，因此其功能还不为人知。

Mojica教授推断，如果两种有着巨大差异的微生物里都有这种奇怪的序列，这就说明它肯定有着某种特殊的功能。后来，他又发现大约另外20多种微生物里，同样具有CRISPR序列。这种奇怪序列的功能，却迟迟未能得到解答。

为了寻找CRISPR序列的功能，Mojica每天都在数据库里搜索，想发现这些奇怪序列的意义。2003年，Mojica发现，一些大肠杆菌内的CRISPR序列，与一种叫做“P1噬菌体”的病毒的序列高度吻合，这种噬菌体能攻击大肠杆菌，但这批大肠杆菌竟完全不受P1噬菌体的感染。这与人类免疫系统相似，免疫系统记住过去遇到过的病原体模样，病原体入侵人体后，免疫系统会对其进行攻击，大肠杆菌细胞内，CRISPR序列也能让细菌记住噬菌体的模样，抵抗病毒感染。

Mojica的研究论文在《自然》、《美国国家科学院院报》、Molecular Microbiology和Nucleic Acid Research等杂志拒稿后，发表在Journal of Molecular Evolution(影响因子不到2分)杂志上。

接下来的几年里，研究者们对CRISPR序列的作用做了进一步的完善，并阐明了详细机理。在病毒感染细菌后，CRISPR序列会喊来帮手，形成一个具有核酸切割能力的复杂结构，最终切断病毒的DNA。对于细菌来说，这是从源头清除病毒感染的好方法。

这套细菌的“免疫系统”让生物学家看到了精准切割DNA的希望，或许可以藉此开发一种高效的基因编辑方法。

2012年，奥地利Emmanuelle Charpentier教授与美国加州大学伯克利分校Jennifer Doudna教授在《科学》杂志上发表了她们的发现，她们所设计的CRISPR-Cas9基因编辑系统(Cas9是一种能切割DNA的内切酶)能在DNA的特定部位“定点”切割，认为将来或可利用这个系统对基因组进行编辑。

在立陶宛，一名叫做Virginijus Siksnys的科学家也在研究使用CRISPR系统编辑基因的潜力。虽然他的论文投的时间更早，但不幸被《细胞》杂志编辑拒稿，只能转投《美国国家科学院院报》，使得他的论文最终要晚2个月上线。

2013年初，《科学》杂志再度刊登了一篇关于CRISPR系统的重磅文章。主导这项研究的是美国Broad研究所的张锋教授。研究者首次将CRISPR技术应用到了哺乳动物细胞内，并证明它能在短短几周之内，建立起小鼠的疾病模型。该团队也首次在人类细胞中成功使用CRISPR-Cas系统完成了基因编辑。

自CRISPR-Cas9基因编辑技术诞生以来，科学家们对其进行了大量的优化与改造。一方面，现在的CRISPR基因编辑技术可以变得更精准，带来更少的脱靶效应(指修改了不应修改的基因);另一方面，CRISPR系统也已经超越了DNA，能对RNA进行有效编辑。

初代的CRISPR技术涉及DNA双链的断裂，会引起潜在的风险。如今，科学家们基于CRISPR体系，已经开发出了“单碱基”基因编辑系统，能对基因进行“微调”，这种“单碱基”基因编辑系统有着更高的精度。

CRISPR技术三巨头专利之争

自CRISPR技术问世以来，就一直被诺奖候选的光环所环绕，人们虽然确信CRISPR基因编辑技术迟早会得诺奖，但哪几位科学家能最终获奖，大家看法也不同。有关CRISPR基因编辑技术的专利也一直是个热议的问题，迄今也未得到完美解决。

2012年8月17日， Jennifer Doudna和Emmanulle Charpentier合作，在 Science 杂志发表了基因编辑史上的里程碑论文，成功解析了CRISPR/Cas9基因编辑的工作原理。2013年2月15日， 张锋在 Science 杂志发表了， 首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞。自此，近年来生命科学领域最耀眼的技术正式宣告诞生，Jennifer Doudna、Emmanulle Charpentier、张锋三人，也被人们称为 CRISPR基因编辑三巨头。

三巨头在CRISPR基因编辑领域接连取得重要进展，发表了大量重磅论文。由于CRISPR基因编辑技术在疾病治疗、疾病检测、遗传育种等领域有着巨大优势和前景，三巨头分别成立公司，开始CRISPR基因编辑的商业化应用。如今三家公司均在CRISPR基因编辑治疗遗传病领域取得了许多突破，张锋的Editas Medicine已开始基因编辑治疗先天性黑蒙症10型的临床试验，另外两家公司也在治疗某些罕见遗传病的临床试验中取得进展。

为了CRISPR的专利归属权，Doudna和Charpentier曾与华裔科学家张锋对簿公堂。虽然Doudna在2012年5月25日就提交了保护CRISPR技术的专利申请，但七个月后提交专利申请的张锋却先拿到了专利授权。2014年4月15日，美国专利局将CRISPR-Cas9技术的专利颁发给张锋所在的Broad研究所。2016年1月，加州大学相关组织要求对Broad研究所的最早专利以及另外多项专利进行专利干涉，这个请求很快得到了相关部门的受理。不过经过一系列的专利争夺战之后，美国专利局在2017年2月15日判定：CRISPR关键专利仍然归张锋团队所有。

张锋是华人生物学界最耀眼的新星，风投竞相追逐的对象，诺贝尔奖的大热门。2013年，张锋发现CRISPR/Cas系统可用来编辑DNA，使基因疗法成为可能，获得美国瓦利基金青年研究家奖，2014年被《Nature》杂志评为2013年度十大科学人物，获得一系列最高荣誉，获得美国首个CRISPR专利后，宣布对学术界开放CRISPR/Cas9基因编辑的专利，只要研究不是出于商业目的，就可以随意免费地使用。不仅如此，他还把自己的研究资源放到公共库Addgene中，免费分发于天下。自CRISPR/Cas9发明以来，其一半重大突破都出自张锋之手。

至于到底谁才最应该拥有CRISPR基因编辑发明人及荣誉和利益，学界的普遍看法是，Charpentier和Doudna推动了CRISPR编辑的发展，张锋则是通过证实它能在真核细胞中起作用而揭示了它的巨大潜力，来自哈佛医学院的George Church则又独立证实了张锋的这一研究发现。

张锋曾提供他的实验室详细实验记录，明确记录着他早在其他两位科学家论文发表之前就走在了他们的研究进度前，他在2012年年初就创建并运行了CRISPR-Cas系统，是第一个在人体细胞中使用CRISPR-Cas的人。这早于Jennifer Doudna 和Emmanuelle Charpentier的专利申请的提交时间，甚至也早于她们在Science上发布自己的研究成果的时间。Jennifer Doudna在她早期专利申请中的预测CRISPR将会对人类细胞有用只是一种泛泛的猜想，而张锋是第一个证明CRISPR惊人作用的人。

CRISPR技术在肿瘤中的应用

CRISPR该技术为生命科学带来了革命性影响，有可能使治愈遗传性疾病变成现实，正在为治疗肿瘤的新方法做出贡献。

1 利用CRISPR技术可以建立肿瘤的动物模型

传统制作小鼠模型的方法是在小鼠胚胎干细胞中引入突变，然后将干细胞注射到胚囊中形成嵌合体小鼠，再经过一代才能获得纯合突变的小鼠。CRISPR/Cas9技术有效地提高了制作小鼠模型的效率。

染色体重排是很多肿瘤发生的原因。运用传统的方法制作染色体重排的癌症模型，需要在两个重排位点加上loxP序列，通过Cre-loxP重组制作染色体重排。运用CRISPR/Cas9技术产生染色体重排非常简单，只需要靶向切割两个重排位点就可以了。比如人类2号染色体重排会导致EML4-ALK融合表达，引发非小细胞肺癌，用CRISPR/Cas9建立EML4-ALK融合基因肺癌小鼠模型就容易得多。

2 找到肿瘤的致病或转移的基因

很多情况下肿瘤是多个基因突变协同作用的结果，如何找出引发癌症的关键突变是个难题。张锋团队运用CRISPR/Cas9文库对一个不具备转移能力的肺癌细胞系进行了高通量的单基因随机敲除，然后移植到免疫缺陷的小鼠中，其中一些细胞离开了原有的位置随着血管迁移形成了高转移性的肿瘤;通过对转移性肿瘤的sgRNA测序，筛查到了与肿瘤生成和转移相关的多个基因以及mRNA。

3 用于肿瘤治疗

CRISPR/Cas9在治疗癌症上有几种应用的可能：直接攻击癌细胞中的关键基因;用于编辑免疫细胞，通过免疫细胞攻击肿瘤细胞。在NIH临床试验注册官网http://www.网站上搜索CRISPR，有不少项与CRISPR/Cas9相关的临床试验，其中24项与肿瘤治疗相关。值得一提的是，我国四川大学华西医院的卢铀教授团队开展了全球第一例应用CRISPR/Cas9技术的治疗肺癌的人体临床试验。

CRISPR/Cas9在最近很火的CAR-T疗法和免疫检查点疗法(PD-1/L1)中有很多的应用。CRISPR/Cas9技术可以提高CAR-T细胞的制备效率，CAR-T疗法通过采集患者的T细胞进行基因修饰，成为CAR-T细胞后输入患者体内，过程用时长、难度高且成本大，还有T细胞自身的治疗数量限制。而CRISPR-Cas9基因编辑技术能明显提高CAR-T细胞的制备效率，其对一个正常的免疫T细胞进行基因改造，在引入CAR序列时去除T细胞内源性αβT细胞受体基因和人白细胞抗原 I(HLA I)类编码基因，以防止用于不同患者时产生抗宿主反应。

CRISPR技术可以提高CAR-T细胞的功能，CRISPR/Cas9技术可以通过敲除编码信号分子的基因或T细胞抑制性受体的基因来提高CAR-T细胞的功能。CAR-T细胞疗法的抗肿瘤疗效显着，但只能特异性识别肿瘤细胞表面受体，而肿瘤特异性T细胞受体(TCR-T)细胞能够通过基因修饰表达特异性受体，识别肿瘤细胞表面经Ⅰ类主要组织相容性抗原呈递的抗原肽从而识别胞内特异性分子。但受体T细胞中存在的内源性TCR与修饰后的TCR可能会存在竞争反应，因此采用CRISPR-Cas9 基因编辑技术制备TCR、HLAⅠ类分子和PD-1缺失的CAR-T细胞，使其异体反应降低又不引起抗宿主疾病，体内抗肿瘤疗效也得到提升。

CRISPR/Cas9在免疫检查点药物(PD-1/L1)中也有很多应用，通过CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除参与免疫负调节的基因，也能达到同样的抗肿瘤效果，是一种全新的治疗思路。利用电穿孔方法将Cas9和sgRNA导入T细胞并敲除PD-1基因，使其表达减少，长时间的体外培养过程中没有发现PD-1对T细胞活化的影响，使T细胞更好地发挥其抗肿瘤疗效。这种新的阻断疗法常常与过继性T细胞免疫疗法结合使用，可以增强免疫细胞的活性。

CAR-T领域的先驱Carl June教授发表研究证实，体外和动物模型研究中，用CIRSPR技术敲除TCR和B2M这两个和免疫排除有关的基因后，T细胞同种异体反应性降低，且未导致GVHD。

综上，CRISPR/Cas9技术在肿瘤的诊疗和研究中有很多的应用前景，该技术可能把肿瘤治疗推进到一个新时代。但CRISPR/Cas9技术也有它的问题，比如脱靶的问题、伦理学的问题等。

(编撰 尹勇)