由国家肝癌科学中心王红阳院士和南方医科大学南方医院侯金林教授牵头开展的一项HCC早筛研究显示，基于游离DNA(cfDNA)的HIFI(5-Hydroxymethylcytosine/motIf/Fragmentation/nucleosome footprInt)方法在鉴别HCC和非HCC人群上具有高度准确性，可作为HCC早期诊断和筛查的新策略。(Cell Res. 2021年2月15日在线版 doi: 10.1038/s41422-020-00457-7)

肝细胞癌(HCC)是世界范围内死亡率位居第二位的恶性肿瘤，对于HCC的早期诊断可以提供手术等根治性治疗的机会而改善预后。肝硬化可使每年HCC发病率升高2%~4%，肝硬化发展为HCC涉及一些基因或表观遗传改变。由于目前诊断方法准确性有限，亟需在肝硬化患者中探索新型非侵入性策略来进行HCC的早期诊断。

研究者从中国11个省的13家医院收集2250例肝硬化患者、508例HCC患者和476例健康对照者(CTRL)的cfDNA，随机分为训练、验证和检验队列以建立和评估诊断模型。使用最先进的二代测序(NGS)获得全基因组cfDNA的5-羟甲基胞嘧啶(5-hmc)，核小体印迹(NF)，5'端末端序列和片段特征。

研究最终纳入3204例患者，发现HCC和CTRL患者具有不同的5-hmc修饰表现。NF分析显示差异基因的检测覆盖具有足够鉴别HCC和CTRL的效力。256个末端序列特征也是潜在的区分HCC和CTRL的参数。HCC cfDNA片段大小的变异性更大，片段更短(中位长度<150 bp)。总体而言，所有4个特征显示良好的诊断潜力。

整合上述4个基因组特征的HIFI方法鉴别HCC和肝硬化具有很高的诊断价值，在验证队列中(95例HCC，100例肝硬化)对HCC的诊断敏感性达95.79%，特异性达95.00%，在检验队列中(148例HCC，1800例肝硬化)敏感性达95.42%，特异性达97.83%。

HIFI方法鉴别HCC和肝硬化的效力(验证队列，AUC=0.995;检验队列，AUC=0.996)优于甲胎蛋白(AFP，验证队列，AUC=0.845;检验队列，AUC=0.826)。此外，HIFI方法在鉴别HCC和非HCC(肝硬化+CTRL)及CTRL上均具有良好的诊断表现。

不论是验证队列(AUC=0.971)还是检验队列(AUC=0.973)，NF均为鉴别HCC和肝硬化最好的诊断特征。此外，其他3个基因特征也比AFP表现更佳(验证队列，AUC=0.845;检验队列，AUC=0.826)。HIFI方法优于其他基因特征的诊断效力也体现在鉴别HCC和非HCC或CTRL上。

为了获得最佳模型，研究者评估了基因特征不同组的诊断效力，结果显示HIFI优于任何其他基因特征组合。此外，HIFI方法在5-hmc误诊的病例中也具有更高的准确性。此前的研究显示32个5-hmc标志物的诊断评分具有良好的HCC诊断效力，而在验证队列和检验队列中的评估显示5-hmc的诊断准确性劣于HIFI评分。

cfDNA浓度在不同个体中差别很大，HCC组最高。为了检验临床中应用的可行性，在HCC/ 肝硬化样本中重复评估了不同DNA输入量和不同批次5-hmc测序/全基因组测序(WGS)数据的一致性，发现具有高度一致性，提示5-hmc测序/低通量WGS用于临床的可行性。此外，尽管肝硬化患者片段大小显著更长，cfDNA浓度更低(<10 ng/mL)，但HIFI方法的诊断表现不受cfDNA浓度影响。

研究者还分析了地理分布偏倚，发现4个特征在11个省的样本中稳定且表现良好，而HIFI具有更好的准确性。HIFI评分从CTRL到HCC患者具有逐渐升高的趋势。肝硬化队列中，有或无腹水的患者HIFI评分具有显著性差异。HIFI与Child-Pugh评分、总胆红素水平、白蛋白水平呈现负相关，而与血小板水平正相关。在HCC队列中，肿瘤体积更大(>5 cm)和更高的PIVKA-Ⅱ水平具有显著更高的HIFI评分。伴有肝硬化史的HCC患者HIFI评分更高。

在肝硬化患者亚组中评估HIFI方法的诊断价值发现，HIFI方法在易于被误诊为HCC的AFP阳性患者中具有更高的准确性。HIFI方法也能准确鉴别AFP阴性HCC和肝硬化。此外，无论年龄、Child-Pugh分类和HBV感染状态，HIFI方法比AFP具有一致且更高的准确性。但是HIFI的准确性在伴有糖尿病和高血压的肝硬化患者中轻微下降。

在HCC中，HIFI方法在AFP阴性和PIVKA-Ⅱ阴性患者中都具有高诊断准确性。更重要的是，HIFI方法在发现早期HCC和极早期HCC极具效力，AFP/PIVKA-Ⅱ的早期HCC诊断准确性大大低于HIFI方法。联合AFP/PIVKA-Ⅱ和HIFI不能改善诊断准确性。HIFI方法在诊断小HCC(直径<3 cm，96.7%)上具有良好表现，而AFP和PIVKA-Ⅱ和肿瘤大小正相关。在AFP/PIVKA-Ⅱ误诊HCC病例中，HIFI达到很高的准确性(93.9%/90.9%)。

人类基因组的5-hmc修饰影响基因表达活性，而NF反映了转录起始和延长，研究发现多种5-hmc和NF标志物在HCC中强烈富集。其他两个片段标志物，末段序列和片段大小携带了组织来源信息，它们在HCC生成中的机制还需要进一步研究。

该研究基于cfDNA独特的基因组特征开展了大规模、多中心研究，建立了诊断HCC的新型整合方法。HIFI方法在鉴别HCC和肝硬化及CTRL中具有高度准确性，可以作为HCC早期诊断和筛查的新策略，有望满足发现早期HCC的迫切需求。

研究尚存在一些局限性，例如队列的患者均来自于中国，由于研究的主要目的是鉴别HCC和肝硬化，CTRL数量较小。但是考虑到其高度准确性、非侵入性和通用性，HIFI方法在高危人群的公共卫生筛查中具有极大的潜在价值。

(编译 王钰)